這種技術(shù)是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，并以針對(duì)特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測之。Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。這種技術(shù)的作用是對(duì)非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進(jìn)行鑒別和鑒定。
儀器：高壓鍋、玻璃勻漿器、高速離心機(jī)、分光光度儀、—20℃低溫冰箱、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置、恒溫水浴搖床、多用脫色搖床。
試劑：單去污劑裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分離膠、4％濃縮校、G250考馬斯亮藍(lán)溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、10X麗春紅染液、封閉液、TBST、TBS、洗脫抗體緩沖液、顯影液、定影液、抗體、化學(xué)發(fā)光試劑。
雜品與耗材：各種規(guī)格的吸頭、離心管和加樣器；各種規(guī)格的燒杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纖維素膜，乳膠手套，保鮮膜，搪瓷盤（>20×20cm），X-光片夾，X-光片，玻棒長短各一根，計(jì)時(shí)器，吸水紙，
試劑配制：
（一）母液
1.0mol/L Tris·HCl
            Tris (MW121.14)          30.29g
             蒸餾水                 200ml
溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至所需點(diǎn)（見下所示），zui后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。
                    PH           HCl
                    7.4         約17ml
                    7.5         約16m
                    7.6         約15ml
8.0                               約10ml
 
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF
          PMSF          0.174g
          異丙醇         100ml
溶解后，分裝于1.5ml離心管中，－20℃保存。
 
0.2mol/L NaH2PO4
              NaH2PO4（MW119.98）          12g
                蒸餾水至                      500ml
 溶解后，高壓滅菌，室溫保存。
 
0.2mol/LNa2HPO4
Na2HPO4·12H2O（MW 358.14）  71.6g
蒸餾水至                       1000ml
溶解后，高壓滅菌，室溫保存。
 
10％SDS
             SDS                  10g
           蒸餾水至               100ml
50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
 
10％過硫酸胺（AP）
過硫酸胺             0.1g
                  超純水               1.0ml
溶解后，4℃保存，保存時(shí)間為1周。
 
1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）
                  Tris (MW121.14)         45.43g
                   超純水                200ml
溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，zui后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。
 
0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）
Tris (MW121.14)         15.14g
                   超純水                200ml
溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8，zui后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。
 
40％Acr/Bic（37.5：1）
                  丙稀酰胺（Acr）            37.5g
甲叉雙丙稀酰胺（Bic）         1g
超純水至                     100ml
37℃下溶解后，4℃保存。使用時(shí)恢復(fù)至室溫且無沉淀。
 
20％Tween20
Tween20          20ml
蒸餾水至         100ml
混勻后4℃保存。
 
（二）使用液
 
單去污劑裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100mg/ml PMSF）：
        1mol/L Tris·HCl（pH8.0）  2.5ml
NaCl                0.438g
TritonX－100             0.5ml
蒸餾水至                50ml                
混勻后， 4℃保存。使用時(shí)，加入PMSF至終濃度為100mg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。
 
0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）
0.2 mol/L NaH2PO4         19ml
0.2 mol/L Na2HPO4         81ml
NaCl                    17g
蒸餾水至              2000ml
 
G250考馬斯亮藍(lán)溶液（測蛋白含量）
                  考馬斯亮藍(lán)G250：  100mg
                  95％乙醇：         50ml
                  磷酸：             100ml
                  蒸餾水至           1000ml
配制時(shí)，先用乙醇溶解考馬斯亮藍(lán)染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4℃保存。
 
0.15 mol/L NaCl
NaCl（MW58.44）   0.877g
蒸餾水至          100 ml
高溫滅菌后，室溫保存。
 
100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
          BSA        0.1g
      0.15 mol/L NaCl   1ml
溶解后，－20℃保存。制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，用0.15 mol/L NaCl進(jìn)行100倍稀釋成1mg/ml，－20℃保存。
 
10％分離膠和4％濃縮校
               10％分離膠（兩塊膠，10ml）               4％濃縮膠（兩塊膠，5ml）
超純水                         4.85ml                         3.16ml
40％Acr/Bic（37.5：1）          2.5ml                           0.5ml
1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）      2.5ml                           －
0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8）       －                            1.26ml
10％SDS                         100 ml                        50 ml
10%AP（過硫酸胺）              50 ml                          25 ml
TEMED                          5 ml                           5 ml
 加TEMED后，立即混勻即可灌膠。
 
還原型5XSDS上樣緩沖液（0.25mol/L Tris·HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％ SDS，0.5％溴酚藍(lán)，50％甘油）
             0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8）    2.5ml
           二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）    0.39g
                    SDS                   0.5g
溴酚藍(lán)                 0.025
甘油                   2.5ml
 
   混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4℃保存。
 
電泳液緩沖液（25mmol/L Tris，0.25mol/L*，0.1％ SDS）
                Tris（MW121.14）          3.03g
                *（MW75.07）        18.77g
SDS                        1g
蒸餾水至                 1000ml
   溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用3～5次。
 
轉(zhuǎn)移緩沖液（48mmol/L Tris，39mmol/L*，0.037％ SDS，20％甲醇）
*（MW75.07）        2.9g
Tris（MW121.14）          5.8g
SDS                      0.37g
甲醇                     200ml
蒸餾水至                 1000ml
溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用3～5次。
 
10X麗春紅染液
麗春紅S         2g
三氯乙酸        30g
磺基水楊酸      30g
蒸餾水至       100ml
使用時(shí)將其稀釋10倍。
 
TBS緩沖液（100mmol/ L Tris·HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）
 
1 mol/ LTris·HCl（pH7.5）  10ml
NaCl                      8.8g
蒸餾水至                 1000ml
 
TBST緩沖液（含0.05％Tween20的TBS緩沖液）
20％Tween20        1.65ml
             TBS               700ml
             混勻后即可使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。
1*TBST  1L
 
Tris base          2.422g  (MW121.4)
Nacl              8.775g
Tween20          0.5ml
 
封閉液（含5％脫脂奶粉的TBST緩沖液）
脫脂奶粉（國產(chǎn)，安怡牌）          5g
TBST                             100ml
溶解后4℃保存。使用時(shí)，恢復(fù)室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。
 
洗脫抗體緩沖液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5m mol/L Tris·HCl pH6.8）
 
14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巰基乙醇)     700 ml（通風(fēng)廚里加）
               SDS                                  2g
         0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）                 12.5ml
            超純水至                               100ml
配制時(shí)，在通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行。4℃保存?？芍貜?fù)使用1次。
 
顯影液（5X）
 
              自來水（加熱至50℃）      375ml    （以下藥品加到溫水中）
              米吐爾                     1.55g
              亞硫酸鈉（無水）           22.5g
              碳酸鈉（無水）             33.75g
              *                     20.95g
              補(bǔ)水至                     500ml
配制時(shí)，上述藥品應(yīng)逐一加入，待一種試劑溶解后，再加入后一種試劑。4℃保存。使用時(shí)用自來水稀釋至1倍。
定影液
自來水（50～60℃）     700ml （以下藥品按順序加入前者溶解后再加后者）
*           240g
亞硫酸鈉（無水）     15g
冰乙酸               12.6ml
硼酸                 7.5g
鉀明礬                15g（水溫冷至30℃以下時(shí)再加入）
加水定容至1000ml，室溫保存
 
抗體
      用TBST稀釋至一定濃度使用，每張膜需0.5ml
化學(xué)發(fā)光試劑
購自北京中山公司，為Santa Cruz產(chǎn)品，分A和B兩種試劑。
操作步驟：
（一）  蛋白樣品制備
（1）       單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?br />1、  倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
2、  每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
3、  按1ml裂解液加10 ml PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）
4、  每瓶細(xì)胞加400 ml含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。
5、  裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）
6、  于4℃下12000rpm離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）
7、  將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min的離心管中放于－20℃保存。
（2）       組織中總蛋白的提取：
1、  將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
2、  加400 ml單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。
3、  幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。
4、  裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。
（3）       加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?br />由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?br />1、  將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。
2、  棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。
3、  用槍洗干上清后，加100 ml裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。
4、 將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。
（二）  蛋白含量的測定
（1）       制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
1、  從－20℃取出1mg/ml BSA，室溫融化后，備用。
2、  取18個(gè)1.5ml離心管，3個(gè)一組，分別標(biāo)記為0mg，2.5mg，5.0mg ，10.0mg ，20.0mg ，40.0mg。
3、  按下表在各管中加入各種試劑。
 
0mg
2.5mg
5.0mg
10.0mg
20.0mg
40.0mg
1mg/ml BSA
－
2.5ml
5.0ml
10.0ml
20.0ml
40.0ml
0.15mol/L NaCl
100ml
97.5ml
95.0ml
90.0ml
80.0ml
60.0ml
G250考馬斯亮藍(lán)溶液
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
 
4、  混勻后，室溫放置2min。在生物分光光度計(jì)（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。
5、  
 
（2）       檢測樣品蛋白含量
1、  取足量的1.5ml離心管，每管加入4℃儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測蛋白。
2、  取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15mol/L NaCl溶液100 ml，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品。
3、  棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用無菌水洗一次。
4、  取一管考馬斯亮藍(lán)加95 ml 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。
注意：每測一個(gè)樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無, 菌水洗一次。可同時(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測，這樣對(duì)測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測得的結(jié)果是5 ml樣品含的蛋白量。
（三）  SDS－PAGE電泳
（1）       清洗玻璃板：
一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。
（2）       灌膠與上樣
1、  玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。）
2、  按前面方法配10％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）
3、  當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
4、  按前面方法配4％的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
5、  用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）
6、  測完蛋白含量后，計(jì)算含50mg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5ml離心管中，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15ml，加樣孔的zui大限度可加20ml樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白變性。
7、  加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。
（3）       電泳
電泳時(shí)間一般4～5 h，電壓為40V較好，也可用60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
（四）  轉(zhuǎn)膜
（1）       轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3cm的濾紙和1張7.3～8.6cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會(huì)阻止膜吸水。
（2）       在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。
（3）       將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。
（4）       要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。zui后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通。）
（5）       將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60V轉(zhuǎn)移2 h或40V轉(zhuǎn)移3 h。
（6）       轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。 將膜晾干備用。 
（五）  免疫反應(yīng)
（1）       將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h。
（2）       將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5ml離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。
（3）       同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
（六）  化學(xué)發(fā)光，顯影，定影
（1）       將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。
（2）       在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大1cm）；打開X-光片夾，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾，開始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1min或5min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)*效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為1～2min（20～25℃），溫度過低時(shí)（低于16℃）需適當(dāng)延長顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為5～10min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。
應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，手指甲不要?jiǎng)潅z片，否則會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。
（七）  凝膠圖象分析
將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。