實(shí)驗(yàn)材料
已純化好的Double-Stranded cDNA。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 體外轉(zhuǎn)錄合成*標(biāo)記cRNA
使用Affmetrix IVT Labeling Kit，按操作說明進(jìn)行:
1) 取0.2 ml EP管，加入純化后12ul Double-Stranded cDNA。
2) 室溫下，按照表1依次加入下列組分，輕彈管壁使其充分混勻，瞬時(shí)離心(約5 sec)收集溶液于管底。
3) 37℃溫育16h，之后進(jìn)行下一步。
2. *標(biāo)記cRNA純化、定量和檢測(cè)
1) cRNA純化
a. 加60ul RNase-free Water到IVT反應(yīng)體系中，漩渦3 sec混勻。
b. 加350 ul IVT cRNA Binding Buffer到樣品中，漩渦3 sec混勻。
c. 加250ul無水乙醇到混合物中，移液器吹打充分混勻。
d. 將700 ul混合液轉(zhuǎn)移到IVT cRNA Cleanup Spin Column(置于2ml Collection Tube內(nèi))中，大于等于8000 g離心15 sec，棄濾液和Collection Tube。
e. 將Spin Column轉(zhuǎn)移至新的2 ml Collection Tube中，加500 ul IVTcRNA Wash Buffer到Spin Column中，大于等于8000 g離心15 sec，棄濾液。
f. 加500 ul80%乙醇到Spin Column中，大于等于8000 g離心15 sec，棄濾液。
g. 打開Spin Column的管蓋，zui大轉(zhuǎn)速(小于等于25000 g)離心5 min，棄濾液和Collection Tube。
h. 將Spin Column轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml Collection Tube中，將11 ul RNase-free Water直接加到Spin Column的膜上，zui大速(小于等于25000 g)離心1 min洗脫。
i. 再加10ul RNase-free Water于Spin Column的膜上，zui大速(小于等于25000 g)離心1 min洗脫。
j. 進(jìn)行cRNA定量，如果不馬上定量，則-70℃保存。
2) cRNA定量
a. 按1:100倍稀釋，即2ul cRNA 198ul Nuclease-free Water，用紫外分光光度法測(cè)定cRNA的濃度以及A260/A280。
b. 計(jì)算測(cè)量cRNA產(chǎn)量。
cRNA測(cè)量產(chǎn)量(ug)=cRNA濃度(ug/ul) X稀釋倍數(shù)X cRNA洗脫體積
c. 計(jì)算實(shí)際cRNA產(chǎn)量
實(shí)際cRNA產(chǎn)量=測(cè)量cRNA產(chǎn)量一起始總RNA用量/用于體外轉(zhuǎn)錄cDNA的比例
3) 電泳檢測(cè)
1.2%甲醛變性膠電泳檢測(cè)cRNA片段分布范圍。
3. *標(biāo)記cRNA的片段化及檢測(cè)
使用Affymetrix Sample Cleanup Module，按操作說明進(jìn)行:
1) 按照表2制備片段化反應(yīng)體系，輕彈管壁數(shù)次使其充分混勻，瞬時(shí)離心(約5 sec)收集溶液于管底。
2) 94oC溫育35 min，之后立即置于冰上。
3) 取2 ml片段化產(chǎn)物，用甲醛變性膠電泳檢測(cè)cRNA大小分布范圍，標(biāo)準(zhǔn)的片段化程序?qū)?huì)產(chǎn)生大小分布在35-200 nt的片段化cRNA。
4) 進(jìn)行下一步或于-70oC貯存。
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