技術(shù)大咖秀|“單抗藥物純化工藝探索與開發(fā)”Q&A精彩回顧

十一長假結(jié)束，小編正式回歸。zui近新聞也是目不暇接，前有國人屠呦呦獲諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎，后有AB教主的世紀(jì)婚禮。為了讓還在倒時差的各位親們能更好 的跟上時代的新步伐，小編特意整理了哥家9月 24日下午19:15 ~21:00由資深技術(shù)專家?guī)淼摹皢慰寺】贵w藥物純化工藝探索與開發(fā)"精彩Q&A回顧。錯過的親們，讓我們一起再次感受知識的力量吧！

1干貨回答 讓您分分鐘了解抗體純化工藝

什么是反壓、壓力降？

答疑解惑

“了解基本名詞術(shù)語"

反壓是層析過程中，泵產(chǎn)生流速，流速作用層析柱產(chǎn)生的壓力。如下圖所示：

層析柱的反壓以及壓力降
圖為?KTA Avant 的壓力顯示

0.5MPa 為層析柱的反壓，壓力降為0.3MPa

層析柱產(chǎn)生反壓：主要是層析介質(zhì)，層析柱的設(shè)計，層析柱篩板等。真正影響層析介質(zhì)的為壓力降，壓力降高于層析介質(zhì)的耐壓，層析介質(zhì)會損壞。

層析填料入廠檢驗做哪些比較合適？

答疑解惑

“填料檢驗多重標(biāo)準(zhǔn)"

原料入廠GMP要求做檢測，合格才能進(jìn)廠使用。一般有幾種方法：

Protein A和Protein G兩種介質(zhì)在純化抗體有何區(qū)別，結(jié)合位點各有幾個？

答疑解惑

“Protin A和G的區(qū)別結(jié)合位點"?

各環(huán)節(jié)中濃縮和換液采用膜包還是中空纖維，二者有什么區(qū)別？

答疑解惑

“用途區(qū)別"

“在工藝中區(qū)別"

2、速問速答小問題大門道，好知識速速來襲

層析除病毒驗證，

需要做舊膠的驗證嗎？

答疑解惑

關(guān)于病毒驗證是否需要做舊膠還沒有聽到法規(guī)的要求。新藥報批時一般要求工藝驗證，在工藝驗證中會涉及層析介質(zhì)的壽命。層析介質(zhì)壽命的確定是有效去除雜質(zhì)達(dá)到質(zhì)量要求。親和層析/離子交換介質(zhì)已經(jīng)有文章證明Protein A在壽命內(nèi)有*病毒去除。

非糖基化的抗體

采用什么技術(shù)來去除？

答疑解惑

非糖基化的抗體一般是抗體片段(CHO表達(dá)的為有糖基)，抗體片段一般使用Protein L吸附Fab

陰離子交換低電導(dǎo)較好，但zui近做了DOE，

發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)11比較好，何解？

答疑解惑

陰離子交換一般采用流穿模式（FT），所以需要一定的電導(dǎo)率讓抗體（單體）流穿，其他雜質(zhì)吸附。不同的樣品還是以實驗為準(zhǔn)

能否介紹一些FC-肽融合蛋白的精細(xì)純化方法？

答疑解惑

FC-融合蛋白的的精細(xì)純化一般采用陰/陽離子交換。也有使用HIC，或羥基磷灰石的純化。還要根據(jù)樣品做DOE。

柱高不變，直徑由1.6cm放大到比如20cm，柱壓會增大多少？

答疑解惑

層析放大的原理為直徑放大，柱高不變（即線性流速或保留時間不變）。在放大時層析柱的分配器，以及篩板設(shè)計非常重要。設(shè)計優(yōu)異的柱壓一般不會增大。

工藝驗證中需要確定CQA，CPP，可以針對一個層析方法說明一下確認(rèn)的方法嗎？

答疑解惑

首 先確定不同步驟主要去除雜質(zhì)以及去除雜質(zhì)能力，例如陽離子去除聚體步驟，經(jīng)過此步驟聚體可以從2%降至0.3%。經(jīng)過DOE實驗確定，CPP： 為上樣量（xx-xxmg/ml），樣品電導(dǎo)率（~~），洗脫時的電導(dǎo)率范圍。在以上的條件下可以滿足CQA（0.3%以下）聚體的要求。

陰離子流穿模式，說的載量指的是目的蛋白載量？VH一個domain的純化可以用Protein A親和嗎？

答疑解惑

陰離子流穿模式（FT）的載量指的是抗體的量。一般在上樣是抗體流穿，檢測純度，HCP等，至超標(biāo)時上樣的抗體的量為載量

Protein A （重組的，非修飾的）與VH3結(jié)合

3、案例分享 ?用實驗中的真實案例答疑解惑

有沒有關(guān)于酸堿異構(gòu)體組分降低的案例分享？

答疑解惑

對于酸堿異構(gòu)體的分離一般比較困難，因為差異較小。在GE的應(yīng)用文獻(xiàn)中有使用Capto S ImpAct分離的。一般使用陽離子交換（顆粒小的30-40um），做線性梯度洗脫。也可以在DOE時設(shè)計鹽梯度與改變pH同時的洗脫策略。

現(xiàn)在我做的抗體，proteinA 捕獲時只要載量高就會出現(xiàn)渾濁，低載量澄清？

答疑解惑

宿主DNA和宿主蛋白是否是同步去除的，宿主DNA如何更好去除？

答疑解惑

DNA/HCP一般會同步去除，只是不同步驟去除的量稍有不同。 對于DNA的去除，親和/陽離子交換/HIC不吸附，陰離子交換吸附。只有實驗才能確定您的項目哪種。

抗體的等電點能否用生物信息學(xué)的方法預(yù)測，消光系數(shù)怎么計算？

答疑解惑

一般預(yù)測的軟件得到的一些參數(shù)不是很準(zhǔn)確，不同的表達(dá)系統(tǒng)，不同的培養(yǎng)方法，所得到的等電點不同。所以只能參考。