GE Whatman沃特曼氧化鋁膜在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

Anopore氧化鋁膜是GE醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部Whatman膜產(chǎn)品家族中zui特殊的商業(yè)化無機(jī)膜，它誕生于上世紀(jì) 80 年代末。Anopore *孔隙結(jié)構(gòu)既是各種實驗室的理想過濾介質(zhì)（如圖 1），還在細(xì)胞培養(yǎng)、藥物測試、納米技術(shù)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。Anopore 的孔密度*，現(xiàn)有 200nm、100nm 和 20nm 三種標(biāo)準(zhǔn)孔徑，每個孔之間無橫向交叉，自身蛋白吸附率極低，熒光背底非常小，也是掃描電子顯微鏡（SEM）理想射線穩(wěn)定襯底。因為 Anopore 不含細(xì)胞毒素，剛性表面支持細(xì)胞的附著和迅速生長，濕潤時呈透明狀，在光學(xué)顯微鏡下極易觀察，既適合熒光和免疫熒光染色技術(shù)，又適合電子顯微鏡原位成像，它兼容現(xiàn)有的 DNA 提取技術(shù)，為細(xì)胞培養(yǎng)及其分析提供了極大的便利。

除了常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用外，Whatman 氧化鋁膜（Anopore）還可用于一些比較特殊的應(yīng)用，分別是：抗生素敏感性實驗（AST）、快速藥物敏感性測試（DST）和模擬環(huán)境樣品的組織培養(yǎng)嵌入法（Tissue Culture Insert）。

圖 1 Anopore 膜電子顯微鏡照片

藥物敏感性試驗通常用于了解病原微生物對各種抗生素的敏感或耐受程度來指導(dǎo)臨床用藥。致病微生物在 Anopore 氧化鋁膜上比其他方式培養(yǎng)生長不易受到限制，有效縮短了培養(yǎng)時間。瑞士 Wageningen 大學(xué) C. J. Ingham 等[1]利用 0.2μm 孔徑的 Anopore 氧化鋁膜成功實施細(xì)菌抗生素敏感性試驗。首先將滅菌的 Anopore 放在內(nèi)含抗生素的瓊脂板上，接下來在 Anopore 上接種待測細(xì)菌或真菌，置于 CO2培養(yǎng)箱中于 37oC 培養(yǎng) 40min 或數(shù)小時，然后
用熒光染料 Fun-1 利用 Anopore 毛細(xì)作用對細(xì)胞染色，zui后直接用顯微鏡觀察。研究發(fā)現(xiàn)，白色念球菌在 Anopore 表面可在 60min 內(nèi)檢測到生長，毛癬菌則在 6h 后檢測到生長，檢測MIC 值都與 E 試驗法相當(dāng)而檢測時間更短，圖 2 是 Anopore 上致病微生物成像照片。

圖2 （A）熒光染色大腸桿菌 （B）志賀氏菌在Anopore膜上的SEM形貌 （C）熒光染色熱帶念球菌 （D）伸長型志賀氏菌萌芽管形貌

Anopore還可以縮短總的藥物敏感性測試時間，因為致病微生物可在氧化鋁膜（Anopore）上直接實施培養(yǎng)、殺死、染色和成像等步驟。C. J. Ingham等[2]運用0.2μm孔徑的 Anopore培養(yǎng)接種高傳染性的結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis），其中在Anopore上加入常規(guī)培養(yǎng)基（LJ）和75%甘油供細(xì)菌生長，這種方法zui大程度縮短了測試時間（<3天），將感染性廢棄物降至zui?。?lt;2000個菌株形成單元），同時在Anopore膜上做熒光染色和掃描電鏡分析也極為方便（如圖3）。

圖3 結(jié)核桿菌在Anopore 表面生長的電子顯微鏡照片

未來微生物多樣性的研究將成為熱點，但絕大多數(shù)細(xì)菌在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法中無法培養(yǎng)，比如標(biāo)準(zhǔn)實驗室法培養(yǎng)出的土壤細(xì)菌不到1%。2002年以來，科學(xué)家們采用稀釋培養(yǎng)基、增加接種次數(shù)、模擬自然環(huán)境等來解決上述問題，特別是模擬自然環(huán)境法已從培養(yǎng)海水中難以培養(yǎng)的微生物發(fā)展到培養(yǎng)土壤細(xì)菌中來，基于組織培養(yǎng)嵌入（TCI）的土壤基底膜系統(tǒng)法（SSMS）是目前zui有效的培養(yǎng)土壤細(xì)菌的方法之一。

澳大利亞New South Wales大學(xué)Belinda C Ferrari等[3]運用20nm孔徑的Anopre膜作為TCI多孔板，先在Anopore孔內(nèi)填充環(huán)境土壤細(xì)漿料形成組織培養(yǎng)嵌入（TCI），接著把接種物轉(zhuǎn)移到聚碳酸酯膜（PC膜）上，再將PC膜蓋在反轉(zhuǎn)的（TCI）上，構(gòu)成了土壤基底膜系統(tǒng)（SSMS，如圖4），Anopore還能起到隔離和傳輸培養(yǎng)液的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)接種土壤細(xì)菌經(jīng)過7-10天的孕育期后，即可觀察到土壤菌落（如圖5），通過高靈敏度酶法可提取目標(biāo)土壤細(xì)菌DNA。此外，Anopore組織培養(yǎng)嵌入法還成功應(yīng)用于牛角膜細(xì)胞的培養(yǎng)，即用牛角膜血清、DMEM、抗生素等嵌入Anopore膜形成TCI培養(yǎng)基，培養(yǎng)的牛角膜細(xì)胞可做內(nèi)乳酸鹽-H+的傳輸機(jī)制研究等[4]。

圖4 土壤基底膜系統(tǒng)（SSMS）	圖5 PC膜土壤菌落的熒光顯微照片

參考文獻(xiàn)：

[1] Ingham C., Wever P., Schneeberger P. 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases Nice, France, April 1-4 2006
[2] C. J. Ingham, A. B. Ayad, K. Nolsen, B. MulderRapid drug susceptibility testing of mycobacteria by cultureon a highly porous ceramic support, INT J TUBERC LUNG DIS, 2008, 12(6):645–650
[3] Belinda C Ferrari, Tristrom Winsley, Michael Gillings, Svend Binnerup. C*ting previously uncultured soil bacteria using a soil substrate membrane system. Nature Protocols, 3(8): 1261-1269
[4] Tracy T. Nguyen, Joseph A. Bonanno. Bicarbonate, NBCe1, NHE, and Carbonic Anhydrase Activity Enhance Lactate-H Transport in Bovine Corneal Endothelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2011, 52(11):8086-8093