免疫染色的注意問題

1．免疫染色可在細(xì)胞涂片或組織切片上進行免疫染色。首先，標(biāo)記抗體與標(biāo)本中抗原反應(yīng)結(jié)合。其次，用PBS吸取未結(jié)合成分。zui后，直接觀察結(jié)果(免疫熒光直接法)或顯色后再用顯微鏡觀察(免疫酶直接法)。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出間接法、多層法，雙標(biāo)記法等各種方法。在免疫染色中應(yīng)特別注意增強特異性染色，減少或消除非特異性染色。在各種免疫染色中都應(yīng)注意以下幾個問題：

(1)增強特異性染色方法

1)蛋白酶消化法：目的是暴露抗原，增加細(xì)胞和組織通透性，使抗原抗體zui大限度結(jié)合，增強特異性染色和避免非特異性染色。該法已廣泛用于各種免疫細(xì)胞化學(xué)染色。常用蛋白酶有、及等；酶消化時間和溫度因各種抗原對消化的敏感性不同，應(yīng)根據(jù)酶活性通過預(yù)實驗確定，消化時間還與組織固定的時間有關(guān)，越陳舊固定組織所需時間越長，以37℃為宜。

2)適宜的抗體稀釋度：抗體濃度是免疫染色關(guān)鍵步驟。濃度過高，抗體分子多于抗原決定簇，可導(dǎo)致抗體結(jié)合減少，產(chǎn)生陰性結(jié)果。

3)溫育時間：一般抗體溫育時間為30～60min，必要時可4℃過夜。溫育溫度常用37℃，也可在室溫中進行。37℃可增強抗原抗體反應(yīng)，適用于多數(shù)抗原染色，但應(yīng)注意在濕盒中進行，防止切片干燥而導(dǎo)致失敗。

4)多層染色法：對弱抗原可用直接法(雙層)、辣根過氧化物酶一抗過氧化物酶(PAP)和抗一(ABC)法(j層)，四層或五層PAP法或ABC法，或PAP和ABC聯(lián)合染色法等，可很大程度提高敏感性，獲得良好結(jié)果。

5)其他增敏方法：如微波處理法、酪氨酰胺信號放大技術(shù)(tyramide signal smplmcation，TSA)增敏方法以及免疫PcR方法等。

(2)減少或消除非特異性染色的方法：組織中，非抗原抗體出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色，zui常見原因是蛋白吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上。有效消除方法是在用*抗體前，加與制備*抗體相同的動物的非免疫血清(1：20～l：5)，封閉組織上帶電基團而除去與*抗體非特異性結(jié)合。必要時加入2％～5％牛血清白蛋白，可進一步減少非特異性染色，作用時間為lO～20min。

(3)顯色反應(yīng)的控制：免疫酶染色應(yīng)注意：1)成色質(zhì)濃度和反應(yīng)時間。增加成色質(zhì)的量和(或)增加底物反應(yīng)時間，可增加反應(yīng)產(chǎn)物強度，著色太深可減少反應(yīng)時間。2)過氧化物酶顯色時，H2O2濃度較大將使顯色反應(yīng)過快而導(dǎo)致背景加深，過量H2O2可抑制酶活性。

(4)復(fù)染：根據(jù)所用實驗方法和呈現(xiàn)顏色不同，可選用適當(dāng)復(fù)染方法。如陽性結(jié)果呈紅色或棕色，則用蘇木素將細(xì)胞核染成藍(lán)色，以便定位檢測。

4．對照設(shè)對照目的在于tiEBIj陽性結(jié)果的特異性，排除非特異性結(jié)果。主要針對*抗體對照，常用對照方法包括：陽性對照、陰性對照、阻斷試驗、替代對照、空白對照、自身對照和吸收試驗。

5．免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判斷對免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判斷應(yīng)注意幾點：①準(zhǔn)確判斷陽性和陰性，排除假陽性和假陰性結(jié)果，必須嚴(yán)格對照試驗，對新發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，除有對照試驗結(jié)果之外，應(yīng)進行多次重復(fù)試驗，并用幾種方法進行驗證。②判定特異性染色和非特異性染色：特異性反應(yīng)產(chǎn)物常分布于特定部位，且在同一切片上呈現(xiàn)不同程度陽性染色結(jié)果。而非特異性染色表現(xiàn)為無一定的分布規(guī)律，常呈某一部位成片的均勻著色，細(xì)胞和周圍結(jié)締組織均無區(qū)別著色，或結(jié)締組織呈現(xiàn)很強的染色；常出現(xiàn)于干燥切片邊緣，有由于過強刀痕或自制折疊的部位；在過大組織塊，中心固定不好也會造成非特異染色。當(dāng)非特異性染色和特異性染色同時存在時，過強的非特異性染色背景會影響對特異性染色結(jié)果的觀察和記錄。