western blot實驗步驟和需要儀器

試劑耗材：SDS、甘油、Tris、溴酚藍、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED，APS、、甲醇、PVDF膜、Brandford蛋白定量試劑盒、BSA、脫脂奶粉、考麻斯亮藍、麗春紅、氯化鈉、氯化鉀、DTT、ECL、顯影液、定影液等、顯影膠片。

儀器設(shè)備：超聲儀、核酸蛋白定量儀、Western-blot電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、搖床、曝光合、紅燈等。

樣本準備：收集10⁶細胞，加入150μl SDS裂解液，冰上超聲5次，定量。

SDS-PAGE 電泳：

1. 準備各溶液：小燒杯兩個，5ml槍頭6個，吸水紙，罐膠電泳設(shè)備。

2. 準備罐膠槽：將玻璃板擦干凈，放入短架子內(nèi)，薄板靠門，兩玻璃板及架子的底緣須在同一平面（否則漏膠）；將濕潤的墊片墊于長架子上并鋪上密封膜；將短架子裝在長架子上（短架子底緣須與墊片緊密接觸，否則漏膠）。

3. 準備配膠。   將各溶液（ddH₂O，單體，Tris-HCl，SDS，TEMED，APS）依次擺好，5ml槍頭插于長罐膠槽，調(diào)好取TEMED、APS的槍。

4. 配分離膠：在一小燒杯上裝半杯ddH₂O；另一小燒杯依次加上述各液（加TEMED、APS時要迅速），快速搖勻。注：膠濃度由需要檢測的蛋白大小決定。

5. 罐膠：從玻璃板中間注入膠液，注膠速度均勻，不要產(chǎn)生氣泡。罐膠后用ddH₂O壓膠。

6. 等待時：將Tris-HCl換成pH6.8。換取Tris-HCl及罐膠用的槍頭。調(diào)好各移液器。

7. 30分鐘后：倒掉壓膠水，用濾紙吸干殘留水，注意不要觸及膠面。

8. 配集成膠：見步驟4。

9. 罐膠：見步驟5，灌滿為止，不要有氣泡。

10. 插梳：梳柱下面不要有氣泡。

11. 等待時：A---配電泳緩沖液。B---將樣本煮沸5分鐘。C---水中冷卻，短暫離心后依加樣序排放好。D---等膠近凝時，將玻璃板裝在電泳架子上，罐內(nèi)槽液于槽中，檢查是否密封。E---將上槽架子按于槽中。

12. 30分鐘后：罐上槽液超過短玻璃板，拔梳（注意力道適中，不能太快）。放置上樣架子。

13. 上樣30μl：槍頭先伸入至快接近膠面時開始降將上樣液緩緩打出，使樣品液從膠面往上漲，槍頭隨液面上漲而上提?？梢圆话褄ui后一滴樣品打出，但是每個樣品都須同樣處理。

14. 加外槽液。

15. 電泳。

轉(zhuǎn)膜：

1. 準備：分別準備泡膜和轉(zhuǎn)膜用的試劑和用具，在電泳槽中倒好轉(zhuǎn)膜液

2.揭膠：電泳結(jié)束后，將電泳槽移至水池中，倒掉電泳液，將內(nèi)槽提起放在水池邊，取出兩邊玻璃板。用純水沖干凈玻璃板，小心揭開短板，去掉集成膠，小心將膠轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)膜液在中。

3.轉(zhuǎn)膜：將夾子打開，黑色在底，依次放置海綿、濾紙、膠、膜、濾紙、海綿，關(guān)好夾子（均在液面下進行，注意氣泡）快速放入架子中。在電泳槽中放冰袋。

4.電泳。

封閉及孵抗體：

1. 轉(zhuǎn)膜等待時   準備封閉液（即Non-fat milk 5% in TBST）。

2. 轉(zhuǎn)膜完畢后，  將膜放入封閉液中，輕搖孵育1小時。

3. 孵一抗：將封閉好的膜在轉(zhuǎn)移到一抗盒子中，室溫孵育兩小時或4℃過夜，

4. 洗滌：將孵育好一抗的膜在TBST洗滌3次，每次5分鐘。

5. 孵二抗：將洗好的膜放在二抗中室溫孵育兩小時。

6. 洗滌：將孵育好二抗的膜在TBST洗滌3次，每次5分鐘。

7. ECL化學(xué)發(fā)光和曝光顯影。

western-blot凝膠濃度選擇：