測序策略
目前應(yīng)用的兩種快速序列測定技術(shù)是Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化學(xué)降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都是同樣生成互相獨立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機(jī)終止于特定的一種或者多種殘基上。由于DNA上的每一個堿基出現(xiàn)在可變終止端的機(jī)會均等，因些上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。然后在可以區(qū)分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進(jìn)行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個相鄰的泳道這上，即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。
一Sanger雙脫氧鏈終止法
Sanger法dna測序的試劑
引物
模板
dna聚合酶
放射性標(biāo)記的dNTP
dNTP類似物
現(xiàn)行的邏終止法人加減法序列測定技術(shù)（Sacger和Coulson，1975）發(fā)展而來的。加減法引入了使用特異引物在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)、堿基特異性的鏈終止，以及采用聚丙烯酰胺凝膠區(qū)分長度差一個核苷酸的單鏈DAN等3種方法。盡管有了這些進(jìn)展，但加減法仍然太不，也太不得法，因此難以廣為接受。直至引入雙氧核苷三磷酸（ddTBP）作為鏈終止劑（Sanger等，1977 ），酶法DNA序列測定技術(shù)才得到廣泛應(yīng)用。2’，3’ddNTP與普通dNTP不同之處在同它們在脫氧核糖的3’ 位置缺少一個羥基。它們可以在DNA聚合酶作用下通過其5’ 三磷酸基團(tuán)摻入到正在增長的DNA鏈中，但由于沒有3’羥基，它們不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鏈，因此，正在增長的DNA鏈不可能繼續(xù)延伸。這樣，在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP后， 鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開競爭，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離。在4組獨立的酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。
Sanger法DNA測序的試劑
1．引物
酶促測序反應(yīng)中利用一個與模板鏈特定序列互補(bǔ)的合成寡核苷酸作為DNA合成的引物。在許多情況下，可將靶DNA片段克隆于M13噬菌體或噬菌粒載體，以取得單鏈DNA分子作為模板。但也可以采用Sanger 法商定變性雙鏈DNA模板的序列。在以上兩種情況下， 都可以采用能與位于靶DNA側(cè)翼的載體序列相退火的通用引物，而不必取得與未知DNA序列互補(bǔ)的引物。適于M13噬菌體重組克隆的通用測序引物一般長15-29 個核苷酸，并可與緊靠M13mp18噬菌體多克隆位點區(qū)的HindⅢ位點成M13mp19 噬菌體多克隆位點區(qū)的EcoRI位點的序列互補(bǔ)。這些引物同樣也可用于對克隆于pUC質(zhì)粒的DNA進(jìn)行“雙鏈"測序，并可從許多廠商中購置得到。此外，還有若干家公司出售一些引物，這些引物下為了對通過多種限制酶切位點克隆于不同質(zhì)粒的靶DNA進(jìn)行測序而設(shè)計的。
2．模板
如上所述，有兩類DNA可以用作Sanger 法測序的模板：純單鏈DNA和經(jīng)過熱變性或堿變性的雙鏈DNA。采用通常從重組M13噬菌體顆粒中分離得到的單鏈DNA應(yīng)中獲得數(shù)百個核苷酸的序列。如用變性雙鏈DNA用模板，則較難獲得這咱質(zhì)量的結(jié)果。盡管采用雙鏈DNA模板的方法顯然既簡單又方便（Chen和Seeburg，1985），然而只是在不久前得到改進(jìn)以后， 這一方法才發(fā)展到能夠獲得明確可信結(jié)果的水平。其中有兩個因素是至關(guān)重要的，這就是模板DNA的質(zhì)量和所用DNA聚合酶的種類。小量制箅的質(zhì)粒DNA常常被寡脫氧核糖核苷酸小分子、核糖苷酸及DNA聚合酶的抑制劑所污染，其中前兩種污染物可被用作隨機(jī)引物。結(jié)果，種種“鬼"帶、強(qiáng)終止現(xiàn)象，以及其他假象往往使測序凝膠含混不清、黯然失色。因此采用小量制備的質(zhì)粒NDA來測定未知DNA克隆片段的序列，并不可取。然而,這類DNA?？勺鳛閷σ呀?jīng)通過另一方法測定的序列進(jìn)行進(jìn)一步的合適模板。采用CsCl－溴化乙錠梯度平衡離心法來純化質(zhì)粒DNA，測序的結(jié)果會好得多，但卻要耗費大量的人務(wù)和物力。模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。
