真核細(xì)胞的mRNA在加工過程中有一個(gè)比喻為“穿鞋戴帽"的過程，因此mRNA的3"末端都帶有一段Poly A，這是利用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cdna文庫的基礎(chǔ)。但是由于cDNA的5"端的序列各不相同，如何獲得全長的cDNA，如何擴(kuò)增由微量的mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA文庫、如何利用已知片斷序列得到全長的cDNA（即RACE），曾經(jīng)是一個(gè)令人困擾的問題。
常見的做法是在合成cDNA的雙鏈后在兩端連上接頭，利用已知的接頭序列再進(jìn)行擴(kuò)增，或者是利用末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈cDNA的3"末端加上一連串的G或者C（或者A/T），再通過補(bǔ)齊粘末端，利用已知的兩頭序列進(jìn)行擴(kuò)增。但是這些方法不同程度的存在一些問題，比如接頭的連接效率非常有限，會(huì)導(dǎo)致部分信息的丟失，再加上這些方法需要多次用不同的酶處理有限的樣品，需要經(jīng)過反復(fù)的純化，會(huì)損失很多有用的信息，特別是少量樣品中的低豐度信息，很大程度上會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外由于mRNA容易部分降解，很難確定得到的cDNA是否就是全長的cDNA，還是cDNA的片斷。
SMART技術(shù)的出現(xiàn)是一個(gè)新的里程碑。這個(gè)稱作Switching Mechanism At 5" end of the RNA Transcript(SMART)，原理實(shí)際上非常簡單：在合成cDNA的反應(yīng)中事先加入的3"末端帶oligo（dG）的SMART引物，由于逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達(dá)mRNA的5"末端時(shí)碰到真核mRNA*的“帽子結(jié)構(gòu)"，即甲基化的G時(shí)會(huì)連續(xù)在合成的cDNA末端加上幾個(gè)（dC），SMART引物的Oligo（dG）與合成cDNA末端突出的幾個(gè)C配對(duì)后形成cDNA的延伸模板，逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)自動(dòng)轉(zhuǎn)換模板，以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二鏈后可以利用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。由于有5"帽子結(jié)構(gòu)的mRNA才能利用這個(gè)反應(yīng)得到能擴(kuò)增的cDNA，因此擴(kuò)增得到的cDNA就是全長cDNA。
這個(gè)的方法是利用逆轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)源的末端轉(zhuǎn)移酶活性，只要單管，一步即可完成，不需要額外的cDNA抽提純化或者沉淀，或者額外的酶反應(yīng)，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的cDNA庫，更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，可以應(yīng)用于直接擴(kuò)增基因、構(gòu)建cDNA文庫、已知序列釣全長cDNA（RACE），和用于芯片檢測的cDNA探針的擴(kuò)增等。
我們在這里分別介紹幾個(gè)采用SMART技術(shù)的產(chǎn)品：
一、SMArt pcr cDNA Synthesis Kit
這個(gè)試劑盒是采用SMART技術(shù)將少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA制備成可大量擴(kuò)增的cDNA，提供包括SMART引物、CDS引物、PCR引物、合成*鏈Buffer、dNTP、DTT、Advantage PCR Kit(15rxns)和純化cDNA用的純化柱和對(duì)照RNA在內(nèi)的試劑。其中CDS引物是含有經(jīng)過修飾的Oligo（dT）的起始引物，能特異結(jié)合在mRNA加Poly A的位置，避免結(jié)果有過長的Poly A影響后繼的測序或者PCR反應(yīng)，同時(shí)也可以作為PCR的3"引物。合成的cDNA可以直接進(jìn)行對(duì)數(shù)擴(kuò)增或者線性擴(kuò)增，可以作為定量pcr的模板，也可以直接用于Clontech的抑制性消減雜
