RNA干擾(RNA interference ,RNAi) 現(xiàn)象是一種進(jìn)化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來(lái)病毒侵犯的防御機(jī)制。將與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA(double strand RNA ,dsRNA) 導(dǎo)入細(xì)胞后,能特異性地降解該mRNA ,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失,這一過(guò)程屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范疇。RNAi 廣泛存在于生物界,從低等原核生物,到植物,真菌,無(wú)脊椎動(dòng)物,甚至近來(lái)在哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了此種現(xiàn)象,只是機(jī)制也更為復(fù)雜。
一．RNAi的發(fā)現(xiàn)
早在1990 年進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物有關(guān)研究時(shí)偶然發(fā)現(xiàn),將全長(zhǎng)或部分基因?qū)胫参锛?xì)胞后某些內(nèi)源性基因不能表達(dá),但這些基因的轉(zhuǎn)錄并無(wú)任何影響,并將這種現(xiàn)象稱(chēng)為基因轉(zhuǎn)錄后沉默(posttranscriptional gene silencing ,PTGS) . 1996 年在脈孢菌屬(Neurospora) 中發(fā)現(xiàn)了相似現(xiàn)象,只不過(guò)將這種現(xiàn)象命名為基因表達(dá)的阻抑作用(quelling) . 發(fā)現(xiàn)dsRNA 能夠?qū)е禄虺聊木€索來(lái)源于線蟲(chóng)Caenorhabditis elegans 的研究。1995年康乃爾大學(xué)的研究人員Guo 和Kemphues 嘗試用反義rna 去阻斷par－1 基因的表達(dá)以探討該基因的功能,結(jié)果反義RNA 的確能夠阻斷par21基因的表達(dá),但是奇怪的是,注入正義鏈RNA 作為對(duì)照,也同樣阻斷了基因的表達(dá)。這個(gè)奇怪的現(xiàn)象直到3年后才被解開(kāi)——華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire 和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的Craig Mello 將雙鏈dsRNA ——正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲(chóng),結(jié)果誘發(fā)了比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默。實(shí)際上每個(gè)細(xì)胞只要很少幾個(gè)分子的雙鏈RNA 已經(jīng)足夠*阻斷同源基因的表達(dá)。后來(lái)的實(shí)驗(yàn)表明在線蟲(chóng)中注入雙鏈RNA 不單可以阻斷整個(gè)線蟲(chóng)的同源基因表達(dá),還會(huì)導(dǎo)致其*代子代的同源基因沉默。他們將這種現(xiàn)象稱(chēng)為RNA 干擾。
過(guò)去認(rèn)為, 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不存在RNAi 現(xiàn)象,因?yàn)檩^長(zhǎng)的dsRNA 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能誘導(dǎo)IFN(干擾素) 生成,并激活STAT 途徑參與的PKR(dsRNA 依賴性激酶) 的轉(zhuǎn)錄,同時(shí)dsRNA 本身與PKR 結(jié)合也能令其激活,繼而磷酸化翻譯起始因子eIF2a 使之失活,導(dǎo)致非特異性的蛋白質(zhì)合成障礙;另一方面,dsRNA 又能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白的2′,5′腺苷合成酶,生成 2′,5′腺苷酸,激活非特異性的RNA 酶L ,發(fā)生非特異性的RNA 降解效應(yīng)?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn), 只要dsRNA 短于30bp ,就不會(huì)促發(fā)干擾素效應(yīng),同時(shí)又能特異性地降解mRNA ,引起基因沉默,說(shuō)明dsRNA 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也能發(fā)揮一定作用,為以后的基因治療等RNAi 應(yīng)用領(lǐng)域提供了新的研究方向。
二．RNAi的作用機(jī)制
近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),干擾性小RNA( small interfering RNA ,或short interfering RNAs , siRNA) 是RNA 干擾作用(RNAi) 賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子. siRNA 是一類(lèi)長(zhǎng)約21～25 個(gè)核苷酸( nt ) 的特殊雙鏈RNA(dsRNA) 分子,具有特征性結(jié)構(gòu),即siRNA 的序列與所作用的靶mRNA 序列具有同源性; siRNA 兩條單鏈末端為5′端磷酸和3′端羥基. 此外,每條單鏈的3′端均有2～3 個(gè)突出的非配對(duì)的堿基RNAi 的主要過(guò)程是,dsRNA 被核酸酶切割成21～25 nt 的干擾性小RNA ( siRNA) ,由siRNA 介導(dǎo)識(shí)別并靶向切割同源性靶mRNA 分子. 細(xì)胞中dsRNA的形成是RNAi 的*步. 細(xì)胞中dsRNA 可通過(guò)多種途徑形成,如基因組中DNA 反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;同時(shí)轉(zhuǎn)錄反義和正義RNA ;病毒RNA 復(fù)制中間體;以及以細(xì)胞中單鏈RNA 為模板由細(xì)胞或病毒的RNA 依賴RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA等. 在線蟲(chóng)( C. elegans) 可以直接注射dsRNA 或把線蟲(chóng)浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,還可以通過(guò)喂養(yǎng)表達(dá)正義和反義RNA 的細(xì)菌獲得dsRNA.
現(xiàn)已初步闡明RNAi 的作用機(jī)制. RNAi 的*步是,dsRNA 在內(nèi)切核酸酶(一種具有RNase Ⅲ樣活性的核酸酶) 作用下加工裂解形成21～25 nt 的由正義和反義序列組成的干擾性小dsRNA ,即siRNA.果蠅中RNase III 樣核酸酶稱(chēng)為Dicer. Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 結(jié)合域和PAZ 結(jié)構(gòu)域. 已發(fā)現(xiàn)在Arabidopsis , C. elegans , Schizosaccharomyces pombe 以及哺乳動(dòng)物中也存在Dicer 同類(lèi)物. RNAi 的第二步是,由siRNA 中的反義鏈指導(dǎo)形成一種核蛋白體,該核蛋白體稱(chēng)為RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體( RNA induced silencing complex , RISC) , 由RISC 介導(dǎo)切割靶mRNA 分子中與siRNA 反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域,從而達(dá)到干擾基因表達(dá)作用. RISC 由多種蛋白成分組成,包括內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA 鏈搜索活性等. 線蟲(chóng)C. elegans中的MUT7(一種RNase D樣蛋白) 可能是一種3′5′外切核酸酶. 此外, PAZPPiwi 蛋白家族成員可能是RISC中的構(gòu)成組分,如Arabidposis 中的AGO1 ; N.Crassa 中的QDE; C. elegans 中的RDE1 等,以上這些蛋白與翻譯因子eIF2C 同源.
