我國顏寧課題組從結(jié)構(gòu)上揭示人Ptch1蛋白識別Shh機(jī)制

經(jīng)預(yù)測長1447個氨基酸殘基的人Ptch1蛋白含有12個跨膜區(qū)段（TM），并且與細(xì)菌RND家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（resistance-nodulation-division family transporter, RND家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）存在著結(jié)構(gòu)類似性。Ptch1的跨膜區(qū)段2（TM2）至TM6構(gòu)成固醇敏感多肽區(qū)（sterol-sensing domain, SSD）。人們已在幾種參與固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的蛋白中發(fā)現(xiàn)了SSD。這些含有SSD的蛋白的潛在固醇結(jié)合或轉(zhuǎn)運(yùn)活性的分子機(jī)制仍然是不清楚的。

在一項(xiàng)新的研究中，為了獲得適合于結(jié)構(gòu)研究的樣品，來自中國清華大學(xué)的研究人員基于序列保守性和功能表征獲得幾種人Ptch1的構(gòu)建體。終，在人胚胎腎293F細(xì)胞中瞬時表達(dá)的含有氨基酸殘基1～1305的人Ptch1截短版本在親和層析純化和尺寸排阻層析純化后表現(xiàn)出 足夠的表達(dá)水平和良好的溶液行為。他們還觀察了Ptch1的寡聚體狀態(tài)和單體狀態(tài)。Ptch1的單體形式可適用于單粒子低溫電子顯微鏡分析，

在三種哺乳動物Hh同源物Sonic（Shh）、Desert（Dhh）和Indian（Ihh）中，Shh一直是功能和機(jī)制研究的原型。在大腸桿菌中表達(dá)和純化的人Shh的N-端結(jié)構(gòu)域（ShhN, 氨基酸殘基24～197）能夠在琥珀酸單酯（cholesteryl hemisuccinate, CHS）的存在下與去污 劑溶解的Ptch1蛋白形成一種穩(wěn)定的復(fù)合物。

顏寧課題組分別在3.9埃分辨率下和在3.6埃分辨率下解析出人Ptch1單獨(dú)時以及它與ShhN結(jié)合在一起時的低溫電鏡結(jié)構(gòu)。他們識別出兩個相互作用的胞外結(jié)構(gòu)域ECD1和ECD2，以及12個跨膜區(qū)段（TM1～12）。一旦ShhN結(jié)合，ECD1和ECD2向彼此移動，而且它們一起構(gòu)成ShhN 的?？课稽c(diǎn)。顏寧課題組對ShhN與Ptch1之間的詳細(xì)識別進(jìn)行了分析和生化驗(yàn)證。

在具有或不具有ShhN的Ptch1中觀察到兩個與CHS相一致的類固醇密度（steroid-shaped density）：一個在由這兩個胞外結(jié)構(gòu)域包圍的口袋中，另一個在SSD的膜面向的腔中。基于結(jié)構(gòu)的生化分析揭示出ShhN和Ptch1之間的類固醇依賴性相互作用。相比于野生型Ptch1，類 固醇結(jié)合缺陷型Ptch1突變體的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出顯著的構(gòu)象重排。