支原體菌株來源：M.Arginini ATCC23838 支原體,M.FermentaneATCC19989發(fā)酵支原體 ,M.SalivariumATCC23064唾液支原體 ,M.HominisATCC23114人型支原體 ,M.OraleATCC23714口腔支原體 ,M.HyorhinisATCC29052豬鼻支原體。其共同引物序列來自16s和23s保守區(qū)域，外部引物為Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′，Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；內(nèi)部引物為 Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′，Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。
ＰＣＲ反應(yīng)體系和條件：10×緩沖液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明膠)、ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的濃度為2ｎｍｏｌ/μＬ、2.5ｍＭｄ ＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｈ2Ｏ、石蠟油覆蓋。反應(yīng)溫度和時(shí)間為:94℃/2ｍｉｎ預(yù)變性、94℃/30ｓ變性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸,循環(huán)30次后72℃延伸5ｍｉｎ。第1次ＰＣＲ反應(yīng)取模板10μＬ,第2次ＰＣＲ反應(yīng)以第1次ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物為模板取1μＬ。
下面有更詳細(xì)的：
污染測試--支原體 : PCR方法
原理：
利用具特殊專一性之primers，經(jīng)由PCR反應(yīng)來復(fù)制mycoplasma DNA。所用之primers來自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依m(xù)ycoplsma種類不同而不同，因此可依所復(fù)制之DNA大小及其restriction fragment大小差異來作偵測與鑒定。
特點(diǎn)：靈敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 與快速(一天)。可偵測不易培養(yǎng)之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培養(yǎng)mycoplasma作為正反應(yīng)對照組，避免可能之污染。
缺點(diǎn)︰pcr反應(yīng)很靈敏，易有偽陽性結(jié)果。此方法尚在評估中，故結(jié)果僅作為參考和內(nèi)部品管之一部份。
材料與設(shè)備：
ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.
提供1st stage primer mixture與2nd stage primer mixture
positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)
PCR reagents :
Taq polymerase ( 5 U / ul )
dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )
10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)
25mM MgCl2
sterile ddH2O
Machine / Equipment：
PCR thermal cycler
agarose電泳設(shè)備
DNA電泳膠體觀察設(shè)備
無菌PCR反應(yīng)管
無菌1.5 ml微量離心管
無菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans
方法：
此PCR反應(yīng)是一種nested PCR，包括2階段PCR反應(yīng)，1st stage PCR結(jié)束后，取其反應(yīng)物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR產(chǎn)物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有無及片段大小來分析結(jié)果。
結(jié)果：使用UV light觀察，并照相記錄。
不過應(yīng)用較多還是巢式PCR
方法：
此PCR反應(yīng)是一種nested PCR，包括2階段PCR反應(yīng)，1st stage PCR結(jié)束后，取其反應(yīng)物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR產(chǎn)物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有無及片段大小來分析結(jié)果。
結(jié)果：使用UV light觀察，并照相記錄。
方法再詳盡點(diǎn):
3.1 1st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：
3.1.1 測試樣品 ( 2 ul / each )
3.1.1.1 直接取樣測試細(xì)胞之培養(yǎng)液。
3.1.1.2 Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )
3.1.1.3 Negative control : ddH2O
3.1.2 Reaction mixture ( 23 ul / each )
3.1.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
3.1.2.2 1st stage primer mixture 0.5 ul
3.1.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l
3.1.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
