細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

培養(yǎng)基pH值變化迅速

1.培養(yǎng)箱CO2分壓設(shè)置錯誤  根據(jù)培養(yǎng)基中NaHCO3的濃度增大或降低培養(yǎng)箱CO2的分壓，NaHCO3濃度為2.0-3.7g/L時，應(yīng)相應(yīng)地使用5%-10%的CO2分壓

2.細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶蓋過緊  將瓶蓋旋松1/4圈

3.碳酸氫鹽緩存系統(tǒng)緩沖能力不足   加入HEPES緩沖液，使其終濃度為10-25mM

4.培養(yǎng)基中鹽含量不正確  CO2平衡環(huán)境中使用以Earle平衡鹽為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，大氣條件下使用以Hanks平衡鹽為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基

5.細(xì)菌、酵母或真菌污染   將細(xì)胞和培養(yǎng)基滅菌處理后丟棄

細(xì)胞無法在培養(yǎng)器皿上貼壁生長

1.細(xì)胞消化過度  縮短消化時間或減少用量

2.支原體污染  隔離細(xì)胞，檢測是否感染支原體；清洗通風(fēng)廚和培養(yǎng)箱，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄

3.培養(yǎng)基中無附著因子  如果使用的是無血清配方，應(yīng)確保含有附著因子或者使用經(jīng)過包被的培養(yǎng)板

懸浮細(xì)胞聚集成團(tuán)

1.存在鈣離子和鎂離子  用不含鈣離子和鎂離子的平衡鹽溶液清洗細(xì)胞，輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液

2.支原體污染  隔離細(xì)胞，檢測是否感染支原體；清洗通風(fēng)廚和培養(yǎng)箱，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄

3.蛋白水解酶消化過度導(dǎo)致細(xì)胞裂解、DNA釋放  用0.001%DNA酶I處理細(xì)胞；用PBS沖洗后再接種到新培養(yǎng)基中

細(xì)胞生長緩慢

1.培養(yǎng)基或血清改變  比較不同培養(yǎng)基配方中葡萄糖、氨基酸及其他成分有無差異；通過生長實驗比較新老批次血清有無差異；增大細(xì)胞初始接種密度；使細(xì)胞逐步適應(yīng)新的培養(yǎng)基

2.必需生長促進(jìn)成分（如L-或生長因子）耗竭、缺乏或分解  去除原培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基；向培養(yǎng)基中添加生長促進(jìn)成分（如L-）

3.輕度細(xì)菌或真菌污染  在不添加抗生素的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄

4.時間存儲不當(dāng)  血清應(yīng)于-5℃至-20℃下儲存；培養(yǎng)基應(yīng)于2℃~8℃下避光儲存；盡量減少血清和培養(yǎng)基見光時間

5.細(xì)胞初始接種密度低  增大活細(xì)胞接種密度

6.細(xì)胞衰老、老化  將老化細(xì)胞丟棄，取用代數(shù)較少的細(xì)胞

7.支原體污染  隔離細(xì)胞，檢測是否感染支原體；清洗通風(fēng)廚和培養(yǎng)箱，如細(xì)胞被污染，滅菌處理后丟棄

細(xì)胞死亡

1.培養(yǎng)箱中無CO2  監(jiān)測培養(yǎng)箱中CO2使用速度以便確定及時更換氣瓶；經(jīng)常檢測管路連接處是否漏氣；不要頻繁開啟培養(yǎng)箱門

2.培養(yǎng)箱內(nèi)溫度有波動  監(jiān)測培養(yǎng)箱內(nèi)溫度，及時校正

3.使用抗生素達(dá)到毒性濃度  減少抗生素的用量；使用無血清培養(yǎng)基時，抗生素濃度應(yīng)降低至1/10

4.細(xì)胞復(fù)蘇或凍存時受到損傷  取用新的細(xì)胞

5.培養(yǎng)基的滲透壓不合適  檢查*培養(yǎng)基的滲透壓。大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞可耐受260~350mOsm/kg的滲透壓，加入某些試劑和藥物后會影響培養(yǎng)基的滲透壓；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基的滲透壓（340~380mOsm/kg）要高于哺乳動物細(xì)胞

6.培養(yǎng)基中毒性代謝產(chǎn)物蓄積  去除原培養(yǎng)基，換用新鮮培養(yǎng)基