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上海斯邁歐分析儀器有限公司
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LC/MS 鑒別人參制品及人參植物的種屬差異
2023-6-1 閱讀(51)
摘要有歷史記載以前，人們就已經開始用草藥提取物治療疾病。同種植物常常因地域、氣候、生長條件或亞種不同，具有不同形式的活性成分。中藥（TCM）中使用的一些植物就是例子。人參作為其中的代表，其亞種廣泛分布在整個亞洲和美洲大陸。本應用報告報導了用 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)，配置快速分離高通量（RRHT）柱，對復雜人參提取物中的組分進行分離的方法。用 LC/ESI 八極加速飛行時間（oaTOF）和 LC/離子阱質譜檢測并鑒別了地域或生物源性不同的人參所含化合物的差別?；谝阎慕M分結構信息，通過測定組分譜圖可為人參制品的鑒定提供證據
摘要有歷史記載以前，人們就已經開始用草藥提取物治療疾病。同種植物常常因地域、氣候、生長條件或亞種不同，具有不同形式的活性成分。中藥（TCM）中使用的一些植物就是例子。人參作為其中的代表，其亞種廣泛分布在整個亞洲和美洲大陸。本應用報告報導了用 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)，配置快速分離高通量（RRHT）柱，對復雜人參提取物中的組分進行分離的方法。用 LC/ESI 八極加速飛行時間（oaTOF）和 LC/離子阱質譜檢測并鑒別了地域或生物源性不同的人參所含化合物的差別。基于已知的組分結構信息，通過測定組分譜圖可為人參制品的鑒定提供證據
實驗部分儀器• 帶脫氣機的 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵。該泵能夠用 1.8 µm 粒徑 RRHT 柱進行高分離 HPLC 分析，以獲得最佳分離性能• 帶溫度控制的 Agilent 1200 系列 SL 型高效自動進樣器(h-ALS SL)。該自動進樣器為配合 1200 系列 SL 型二元泵使用而特別設計，具有低的延遲體積• Agilent 1200 系列柱溫箱 (TCC)。該 TCC與 SL 型二元泵一起使用，在優(yōu)化的延遲體積條件下可選擇分離式熱交換器和柱后冷卻，并可選擇 2 位/10 通閥進行交替柱再生• Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢測器 (DAD)。該 DAD 能以高達 80 Hz 的采樣速率采集數據，并具有內置數據存儲功能• Agilent 6210 MSD TOF。八極加速飛行時間質譜儀，帶雙噴霧器接口以進行質量校正，能以最高的準確性獲取分子質量數。該飛行時間質譜儀能以 40 Hz 速率采集數據，還能進行正/負切換• Agilent 6330 離子阱，用于 MSn 串聯質譜實驗的離子阱質譜儀，掃描速度高達每秒 26000 m/z，具有自動數據自適應MSn 功能• LC/離子阱儀器控制軟件為化學工作站B01.03，離子阱軟件 5.3，用離子阱數據分析軟件 3.3 進行數據分析• LC/TOF 儀器控制采用 Mass Hunter 工作站進行數據采集，AnalystQS 進行數據分析• 色譜柱：ZORBAX SB-C18，2.1 x150 mm，1.8 µm
樣品1. 粉碎的凍干人參 (1 g) (Panax ginseng)和 粉 碎 的 凍 干 西 洋 參 (1 g) (Panaxquinquefolius) 分別加入 10 mL 甲醇，超聲處理 30 分鐘，過濾后直接分析2. 糖漿——如韓國人參提取物藥用制品(ILHWA Co., LTD, Korea) (1 g)溶解于100 mL 水/甲醇 (1/1，v/v)中，過濾后直接分析系統(tǒng)設置LC/MS液質聯用儀 系統(tǒng)的設置如圖 1 所示。Agilent1200 系列 SL 型二元泵通過一根 0.17 mm內徑不銹鋼毛細管與 Agilent 1200 系列h-ALS SL 連接。為減少延遲體積，h-ALSSL 的針座毛細管采用 0.12 mm 內徑，用同樣規(guī)格的毛細管在柱溫箱中連接低延5989-5493EN 100遲體積(1.6µL)熱交換器，柱溫箱鏈接色譜柱。將 2 µL 流通池置于 SL 型 DAD 中用于 UV 檢測。出口毛細管直接連在 ESIoaTOF 或離子阱質譜儀的電噴霧源噴霧器上。從人參（Panax ginseng）復雜天然產物提取物的 UV 分析可以看出，對儀器設置進行了優(yōu)化以獲得最高分離度[5]。使用 2.1 x 150 mm，1.8 µm 色譜柱，系統(tǒng)反壓一般在 560 bar 左右。UV 色譜圖中基線分離的色譜峰最大峰寬（FWHM）小于0.1 分鐘。高分離配置的 Agilent 1200 系列二元泵系統(tǒng)的全部性能在另一篇應用報告中介紹[7]。只要稍加改動，這一系統(tǒng)也可以用于高通量分析[8]。
方法• Agilent 1200 系列 SL 型二元泵的操作條件如下：溶劑 A： 水 + 0.1% TFA溶劑 B： 乙腈+ 0.1% TFA流速： 0.5 mL/min梯度： 0 分鐘 5% B1 分鐘 5 % B60 分鐘 85 % B61 分鐘 95 % B70 分鐘 95 % B停止時間： 70 分鐘后運行時間： 15 分鐘• 用 Agilent 1200 系列 SL 型高效自動進樣器進樣 10 µL 樣品，并將樣品冷卻到
合物。實驗證明，在離子阱 MS 基峰色譜圖（圖 2 和圖 3）中，20 到 40 分鐘之間洗 脫 的 主 要 組 分 為 常 見 的 人 參 皂 甙Re、Rg1、Rb1、Rb2、Rc 和 Rd，以及特殊的人參皂甙 Rf 和 F11。1.8 µm 粒徑色譜柱除了具有良好的分離度以外，其分離度還可以隨溫度改善。例如，在 50 °C 柱溫下，所有人參樣品中都含有的人參皂甙 Rem/z 946.5 [M+H]+ 和人參皂甙 Rg1 m/z823.5 [M+Na]+ 分不開（圖 2），但在 80 °C時卻能分離（圖 3）。要用 LC/MS 區(qū)分人參和西洋參，異構體人參皂甙 Rf 和偽人參皂甙 F11 非常有用。對人參的分析顯示，質子化和加合形式的人參皂甙 Rf 分別在 m/z 801.5 和 m/z 823.5 處。在 m/z801.5 處的異構體偽人參皂甙 F11 只能作為痕量化合物檢測（圖 3）。相反，西洋參中卻含有大量偽人參皂甙 F11 ，而不含人參皂甙 Rf。
兩種異構體都有相同的經驗式 (C42H72O14)。這兩種化合物是構造異構體，只在結構式上有區(qū)別。要區(qū)分這些種屬特異性化合物的異構體形式，需要進行 MS/MS 實驗。西洋參樣品的離子阱MS/MS 實驗表明，保留時間 28.5 分鐘的偽人參皂甙 F11 在 m/z 309.1 處斷裂為葡萄糖-鼠李糖二糖部分后，丟失 5 個水分子，依次在 m/z 475.4、457.4、439.3、421.3 和 403.3 處產生離子（圖 4）。最后在m/z 143.1 處產生特殊的呋喃環(huán)碎片。為了確證所提出的碎片結構，我們用高分辨LC/MS oaTOF 高質量精度測量和經驗式確證對該實驗進行了重復（圖 5）。以0.41 ppm 質量精度測量 m/z 801.4997的精確質量，確證了分子離子。以不到2 ppm 的質量精度確證了連續(xù)丟失 5 個水分子產生的 m/z 475.3782、457.3676、439.3569 和 421.3464 碎片的四個經驗式。用 3.10 ppm 質 量 精 度 確 證 了 m/z309.1176 處斷裂的二糖碎片，及 m/z143.1065 處小的呋喃環(huán)碎片（質量精度4.90 ppm）。圖 5 中的表格列出了偽人參皂甙所有碎片的測量質量、計算精度。
與之相比，保留時間 27.7 分鐘的化合物是人參的特征組分，人參皂甙 Rf。LC/MS分析顯示，該化合物也含有質子化的分子離子 m/z 801.5。這是該分子的典型碎片，可用于區(qū)分人參皂甙 F11。MS/MS 分析中，二糖鏈 m/z 325.0 裂解后，連續(xù)丟失4 個水分子（圖 6）。得到的碎片離子質量為 m/z 459.4、441.4、423.4 和 405.4，不同于 F11 分子產物。沒有見到 m/z143.1 碎 片 。為 確 證 鑒 定 結 果 進 行 了LC/MS oaTOF 分析。TOF 圖譜顯示分子離 子 m/z 801.4999， 質 量 精 度 為0.16 ppm（圖 7）。以 0.9 到 1.6 ppm 的質量 精 度 確 證 了 丟 失 水 后 得 到 的 m/z459.3834、 441.3726、 423.3620 和405.3515 碎片。斷裂的葡萄糖二糖的質量在 m/z 325.1134 處以 0.22 ppm 質量精度測定。圖 6 中的表格列出了人參皂
